◎舒思凯
（金华市食品药品检验检测研究院，浙江 金华 321000）
肽是一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基经脱水形成的化合物，是生物体内多种细胞维持功能所需的活性物质。自1920 年肽被发现以来，肽对人体健康的影响，如抗衰、降血脂、降血糖、抗癌、抗炎和提高免疫力等多种功能活性被许多科学家证实，多位科学家因对肽的研究获得了诺贝尔奖。肽也因此在食品、医药、化妆品等领域倍受关注，逐渐成为近年的研究热点。而如何高效制备生物活性肽，对整个肽行业的发展具有至关重要的作用。
因肽结构与其活性具有高度相关性，这对制活性肽的工艺提出了考验，不同工艺制备得到的肽结构及性能会有相应变化。为更经济有效地制备生产活性肽，大量科研人员对肽制备方法及生产工艺进行了研究改进。目前，常用的肽制备手段有化学水解法、酶解法、微生物发酵法和人工合成等方法，本文拟对以上方法进行总结。
食源蛋白质的化学水解通过酸碱催化分解肽键制备生物活性肽，是提高蛋白功能特性的一种方法，有助于研究和开发食源性蛋白在食品和生物医学领域的应用。化学水解分为三类，包括酸水解、碱水解和化学试剂工艺，经常用于从大豆、玉米醇溶蛋白等常见的植物蛋白中制备功能性水解产物[1]。酸水解通常在110～120 ℃使用质子酸进行，而碱水解则在高温（130～180 ℃）下使用强碱（氢氧化钠或氢氧化钾）在水中进行。
由于化学水解具有反应过程困难、氨基酸容易变性、副产物较多且环境不友好等缺点，易使多肽的分子量分布和氨基酸组成不稳定，功能活性低。而化学水解反应过程的精确控制需要更高的技术要求，这无疑会大大增加生产成本。此外，酸碱水解中和后，剩余的酸碱复合物会产生许多无机盐，脱盐使生产过程更加复杂，这些特性限制了化学水解在生物活性肽制备中的应用。
酶解法制肽是指蛋白质中的肽键在蛋白酶水解的作用下断裂，但氨基酸的结构和构型保持不变，在此过程中不会产生有毒有害物质。酶水解是一种公认的高安全性水解方法，整个酶解过程条件温和、易控制、所用设备简单且生产成本低。此外，酶水解在一定程度上可改善蛋白质的功能性质，如蛋白质的溶解度和乳化性，降低蛋白致敏性，更易被人体消化和吸收，并增强生物活性[2]。
多种因素如酶特异性、水解时间、水解程度、酶/底物比率和氨基酸序列均会影响所得到活性肽的组成和功能活性。活性肽生产中常用的蛋白酶可分为两大类：内源酶和外源酶。一般情况下，食源性蛋白中内源酶含量较低，生产中多采用包括碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、黄素酶、中性酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等外源酶进行活性肽制备[3]。研究表明，在不同种类的外源蛋白酶中，碱性蛋白酶对小麦胚芽蛋白具有较高程度的酶解作用。另外，碱性蛋白酶和胰蛋白酶联合酶水解产生的水解产物，比碱性蛋白酶单酶水解产物具有更好的抗氧化活性。
定向酶解是指在受控条件下，使用食品级蛋白酶进行酶水解制备食源性生物活性肽得到目的活性肽[4]。研究显示，食源性蛋白质中存在多种蛋白酶的切割位点。如碱性蛋白酶可以在疏水残基的C 端裂解蛋白质，胰凝乳蛋白酶在芳香和疏水残基C 端裂解蛋白质，而蛋白肽A 的裂解位点在Phe、Leu 或Glu，胰蛋白酶在碱性Lys 或Arg。因此，根据所需肽段结构特征选取相应蛋白酶，在生物活性肽的生产中显得尤为重要。
近年来，微生物发酵也被发现是制备生物活性肽的一种很有前景的方法，尤其是从废弃的蛋白质源中制备肽。微生物发酵是利用发酵菌株产生的酶进行蛋白质水解的过程[5]。如在小麦胚芽的发酵过程中，枯草芽孢杆菌、乳酸菌（LAB）和真菌可以释放许多不同的肽，包括二肽、三肽和其他生物活性肽[6]，其发酵的小麦胚芽提取物可以抑制结直肠癌细胞系HT-29、HCT-8 和DLD-1 的生长[7]，并显著提高粗蛋白、总磷、小肽和游离氨基酸的水平，使中性洗涤剂纤维、半纤维素和植酸酶P 的水平下降[8]。最重要的是，水解过程中没有产生苦味的游离氨基酸。
为了解决从天然产物中提取特定肽段得率较低的问题，科学家们利用重组DNA 技术，通过基因编辑微生物定向发酵制备特定生物活性肽已成为研究热点。如 重 组OSW（Gln-Thr-Phe-Gln-Tyr-Ser-Gly-Trp-Thr-Asn）肽的抗氧化活性比化学合成制备的OSW 肽高了约100 倍[9]。重组DNA 合成耗时、昂贵，且只能合成大分子肽和蛋白质，目前的研究还不成熟，仍处于发展阶段。未来一旦重组DNA 技术体系完善，活性肽可以使用廉价的原材料大量生产，将为活性肽的发展带来巨大的推动作用。
人工合成肽技术发展共经历了三个阶段：经典溶液肽合成（CSPS）、固相肽合成（SPPS）和液相肽合成（LPPS）[10]。CSPS是用于人工合成制备肽最早的方法，该方法制备中使用的肽以及大规模制备中长肽是冗长且非常耗时的。在CSPS 中，肽合成过程中其氨基酸侧链通常不受保护，因此在实际序列的组装过程中可能发生被动修饰，故此后的工艺优化着重于对氨基酸侧链的保护上[11]。诺贝尔奖得主布鲁斯·梅里菲尔德（Bruce Merrifeld）开创性的引入了异相合成，称为固相肽合成（SPPS）[12]。该方法极大地简化了肽合成操作，消除了纯化中间体的需要，将制备指定肽的时间缩短到了几个小时内。此外，SPPS 易于扩大规模，平均每天产量可达数公斤。由于SPPS 过程中会产生大量过量的试剂和每个合成步骤所需的大量溶剂，不符合绿色化学的理念。因此，克服以上挑战，开发能够减少有毒试剂和溶剂、减少缩合剂、减少异构化和其他副产物的技术迫在眉睫。
近年来，对肽合成第三阶段合成路线的关注日益增加，该路线结合了SPPS 和CSPS 的最佳特性，称之为液相肽合成（LPPS）[13]。LPPS 结合了CSPS 和SPPS，使肽链延伸在溶液中进行，此方法生产的肽自带可溶性标签，LPPS 技术在大规模生产肽的过程中可减少过量试剂的使用，符合绿色化学的原则。此外，LPPS 技术合成的肽必须不同于反应过程中产生的副产物的性质，以便通过简单的沉淀、过滤或提取等手段去除。因SPPS 合成过程中的肽由较大的固体聚合物支撑，而LPPS 主要由小分子或可溶性聚合物支撑，故LPPS 所需的溶剂量远少于SPPS。LPPS 可以千克或吨为单位进行生产，可以自动化，生产过程中的能量输入低，并且节省合成材料，消耗成本低。近年来，LPPS 合成过程所用到的标签发生了巨大变化，从多分散聚乙二醇（PEG）到单分散PEG、全氟烷基、离子液体、疏水聚合物和含磷标签。
目前，市场上越来越多的肽类健康食品上市，已有近100 种肽类药物被批准，另有400～600 种在临床前开发中，这反映了人们对活性肽的关注日益增长。然而，目前对肽的研究还不够深入，不同技术方法的制备过程还存在一些问题，如酶利用率低、肽产率低、产物不稳定、纯度低和成本高等。如何绿色、经济的合成活性肽，目前仍是全世界科学家面临的主要挑战。在酶水解的基础上，结合酶固定化和膜分离技术，辅以超声、微波和超高压技术，实现高效、大规模生产生物活性肽已成为研究热点。在生物活性肽的高速发展背景下，应从经济和可持续性角度开发新的肽生产工艺，为肽行业的高速健康发展提供技术支撑。
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